Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность

На правах рукописи


Киль Владимир Ильич


Теоретическое обоснование и практическое внедрение молекулярно-генетических способов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность


Специальность: 06.01.07- защита растений


АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора био наук


Краснодар, 2010


Работа Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность выполнена в муниципальном научном учреждении – Всероссийском научно-исследовательском институте био защиты растений Россельхозакадемии (ВНИИБЗР) в 2001-2010 гг.


Официальные оппоненты:


доктор био наук,

Волчков Юрий Андреевич

доктор био наук,

^ Мироненко Нина Васильевна

доктор био Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность наук,

Антонова Татьяна Сергеевна


Ведущая организация: ГНУ Краснодарский научно-исследовательский институт им. П.П. Лукьяненко


Защита состоится 27 октября 2010 г. в 9.00 часов на заседании диссертационного совета ДМ 220.038.06 при ФГОУ ВПО «Кубанский муниципальный земельный университет» по Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность адресу: 350044, г.Краснодар, ул. Калинина, 13.


С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Кубанский муниципальный земельный университет», с авторефератом – на веб-сайте ВАК: referat_vak@obrnadzor.gov.ru


Автореферат разослан и расположен на веб-сайте « » июля Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность 2010 г.


Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор Горьковенко В.С.

^ ОБЩАЯ Черта РАБОТЫ


Актуальность темы. Для удачного воплощения программ защиты сельскохозяйственных растений от вредных членистоногих нужно исследование биологии и генетики популяций как вредных, так Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность и нужных насекомых. Это содержит в себе познание генетической структуры популяций, миграционных процессов (динамики), акклиматизации, поведенческих реакций, критерий размножения, дела полов и трофических связей.

Значимый прогресс тут был достигнут в 50-60-е годы Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность прошедшего столетия, благодаря использованию традиционных генетических принципов и подходов. Исследование популяционных процессов насекомых исследователи проводили, приемущественно, при помощи видимых и отлично различимых фенотипических маркеров (морфологических и фенетических) таких, как цвет глаз Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность, полосы и пятна, волоски либо шипы на теле особи. Это приблизило ученых к осознанию закономерностей распространения насекомых, их поведенческих реакций, включая половые дела, и наследования отдельных генов, контролирующих те либо другие признаки [Behura Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность, 2006].

Внедрение молекулярно-генетических подходов, начиная с белковых маркеров в 1970-х годах, приемущественно изоферментов и позднее ДНК-маркеров, почти во всем содействовало более глубочайшему осознанию исследуемых закономерностей в популяциях насекомых. Большая часть ДНК-маркеров Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность, применяемых сейчас – это продукты полимеразной цепной реакции (ПЦР). ДНК-маркеры позволяют рассматривать и разъяснять популяционные процессы там, где этого не в состоянии сделать никакие другие способы исследовательских работ. Внедрение ДНК-маркеров Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность нужно для анализа структуры популяций как нужных насекомых – паразитов и хищников, так и вредителей. Не считая того, они могут употребляться для целей таксономии и филогении [Roehrdanz, Flanders, 1993; Mitchell et al., 2006]. С помощью их Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность можно поделить таксоны насекомых, т.е. биотипы, подвиды, близкородственные виды, также виды-двойники, т.е. виды, которые тяжело различить морфологически либо каким-то другим методом [Mitchell et al., 2005, Mitchell, Samways, 2005; Silva Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность-Brandao et al., 2008].

Невзирая на настолько широкие способности ДНК-маркеров, в нашей стране в генетических исследовательских работах популяций вредителей преобладает внедрение морфологических и фенетических маркеров. На их базе исследователи продолжают учить Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность динамику, поведенческие реакции и строят прогнозы о развитии резистентности насекомых к инсектицидам, приемущественно для сельскохозяйственно важных вредителей [Фасулати, Вилкова, 2000; Сухорученко, 2001, 2005; Повелитель, Новосельская, 2001; Беньковская и др, 2004; Ростовцева, 2005].

Невзирая на то, что фенетические Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность маркеры ординарны для использования и нередко появляются в протяжении всего актуального цикла организма, они имеют ряд существенных недочетов. Основными ограничениями их использования будет то, что отлично различимые фены относительно редки и встречаются далековато не Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность у всех видов насекомых. Неувязка идентификации вида по морфологическим признакам в отдельных случаях существенно затрудняется из-за существования видов-двойников. Не считая того, модификационная изменчивость фенетических маркеров, обычно, очень значительна, что затрудняет оценку Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность и прогноз динамики популяционных процессов. Более того, идентификация таких маркеров должна базироваться на знании их генетического контроля и того, как гены, контролирующие этот признак, наследуются в потомстве.

Внедрение для этих Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность целей современных способов молекулярно-генетического анализа, а именно ПЦР-метода и приобретенных на его базе ДНК-маркеров, может почти во всем содействовать решению этих заморочек. Принципиально отметить, что внедрение ДНК-маркеров не Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность преуменьшает внедрения фенетических и других морфологических критериев в практике защиты растений от вредителей, но только дополняет их и расширяет способности для популяционных исследовательских работ видов насекомых, не имеющих точных фенетических признаков Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность, позволяет повысить точность мониторинга и прогноза. Не считая того, с внедрением ДНК-маркеров возникает возможность проследить динамику отдельных генетических частей, отдельных хромосомных локусов, генов и аллелей генов в популяциях, оценить гетерозиготность, гетерогенность и сходство Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность популяций конкретно на генетическом уровне и другие характеристики, которые нереально оценить при помощи морфологических критериев.

Таким макаром, сейчас исследователям недостает четких способов анализа и прогноза в популяциях вредных и нужных насекомых для целей Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность мониторинга и защиты. Существует также недочет познаний о молекулярно-генетической структуре популяций насекомых и закономерностях ее изменчивости под воздействием стрессовых причин наружной среды. В этой связи данные исследования, непременно Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность, животрепещущи и представляют энтузиазм для практики защиты растений от вредных насекомых.

В то же время многие специалисты по сельскому хозяйству считают, что неувязка нехватки продовольствия не может быть решена без внедрения ДНК Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность-технологий и а именно генной инженерии. Генетическая инженерия на самом деле продолжает направление классической селекции по улучшению генотипов нужных растений, но добивается той же цели более действенным и резвым методом. На сегодня генетическая Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность инженерия уже располагает огромным арсеналом познаний и способов для действенного переноса нужных генов из одних организмов в другие [Романов, 2000]. На этой базе уже сделаны многие сорта трансгенных либо генетически-модифицированных растений (ГМР) и некие Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность виды ГМ-насекомых, которые отыскали применение в мировой практике защиты сельскохозяйственных растений от вредителей. Но их внедрение в нашей стране и а именно ГМ-растений сдерживается недостающим исследованием вопросов их Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность экологической безопасности.

В этой связи данные исследования также животрепещущи и могут отыскать свое отражение в практике защиты растений на шаге предрегистрационных испытаний и пострегистрационного мониторинга ГМР и продукции на их базе Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность.

^ Цель и задачки исследовательских работ. Основной целью исследовательских работ являлось теоретическое обоснование внедрения молекулярно-генетических способов в практике защиты сельскохозяйственных растений от вредных насекомых и оценке трансгенных Bt-защищенных растений на экологическую Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность безопасность и на этой базе разработка новых способов мониторинга популяций вредителей и трансгенов.

Для заслуги цели исследовательских работ были поставлены последующие задачки:

  1. Создать новые системы описания феноформ рисунка и расцветки имаго колорадского жука и клопа Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность вредная черепашка.

  2. Изучить ДНК-полиморфизм и генетическое обилие популяций колорадского жука, клопа вредная черепашка, картофельной минирующей моли, хлопковой совки и яблонной плодожорки по RAPD-, ISSR- и SSR-маркерам.

  3. Изучить воздействие инсектицидов Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность, географического положения и критерий года на фенетическую, молекулярно-генетическую структуру и генетическое обилие популяций насекомых-вредителей.

  4. Выявить фенетические и ДНК-маркеры резистентности вредителей к инсектицидам и Bt-картофелю и на этой базе Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность создать новые способы мониторинга резистентности вредных насекомых.

  5. Усовершенствовать способы детекции и количественной оценки трансгенов в биоматериале.

  6. Оценить риск вертикального переноса генов для ГМ-картофеля и кукурузы.

  7. Оценить пролонгированное воздействие трансгенного (Bt) картофеля Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность, устойчивого к колорадскому жуку, на нецелевые виды насекомых, а конкретно на молекулярно-генетическую структуру и генетическое обилие популяции картофельной минирующей моли, также на жизнеспособность насекомых.

^ Научная новизна.

^ Практическая значимость результатов исследовательских работ.

  1. Разработаны системы описания феноформ рисунка и расцветки имаго насекомых, которые рекомендуется использовать для целей фенетического анализа популяций колорадского жука и клопа вредная черепашка.

  2. Разработана Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность методика оценки ДНК-полиморфизма популяций насекомых при помощи ПЦР (RAPD- и ISSR-PCR), которую предлагается использовать для молекулярно-генетического анализа популяций членистоногих.

  3. Предложен подход к поиску резистентных к инсектицидам Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность генотипов в популяциях моновольтинных видов насекомых, основанный на отборе резистентных генотипов в природной популяции вредителя, повсевременно взаимодействующей с инсектицидом.

  4. Разработаны новые способы детекции и полуколичественной оценки трансгенной вставки в биоматериале, которые предлагается использовать в Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность целях резвого и действенного мониторинга ГМ-растений на полях и получаемых на их базе товаров и кормов.

  5. Разработан новый способ мониторинга резистентности колорадского жука к трансгенному (Bt) картофелю по феноформам рисунка переднеспинки Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность имаго.

  6. Предложен подход к оценке пролонгированного воздействия трансгенных растений на нецелевых насекомых и разработана методика оценки воздействия Bt-картофеля на картофельную минирующую моль, которую рекомендуется использовать на шаге предрегистрационных испытаний Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность Bt-картофеля.

^ Главные положения, выносимые на защиту:

  1. Новые системы описания феноформ рисунка и расцветки колорадского жука и клопа вредная черепашка, которые позволяют более отлично проводить анализ популяционных процессов этих видов насекомых, ежели классические. Фенетическая Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность структура популяций насекомых определяется не столько пестицидным фактором, сколько соотношением генотипов с неспецифической устойчивостью к стрессам.

  2. Методика оценки резистентности популяций колорадского жука к Bt-картофелю по феноформам рисунка переднеспинки, с Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность внедрением предлагаемой нами формулы расчета. Внедрение для этих целей фенетических маркеров нужно рассматривать исключительно в качестве подготовительной, грубой оценки.

  3. Новый подход для поиска и идентификации резистентных к инсектицидам генотипов в популяциях моновольтинных видов насекомых Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность, основанный на обработке инсектицидом подборки насекомых из природной резистентной популяции. ДНК-маркеры резистентности к инсектициду Би-58 Новый в популяции клопа вредная черепашка для целей сотворения новых способов мониторинга и прогноза Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность развития резистентности.

  4. Новый подход для оценки пролонгированного воздействия трансгенных растений на нецелевых насекомых биоценоза и методика оценки воздействия трансгенного (Bt) картофеля на картофельную минирующую моль, на базе использования сравнительной оценки генетического контраста и изменчивости молекулярно Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность-генетической структуры внутрипопуляционных групп особей по ДНК-маркерам.

  5. Способ полуколичественной оценки на базе ПЦР по мотивированному гену стойкости к гербициду раундап (СP4 EPSPS) для целей мониторинга на генном уровне измененных источников в Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность зерне и зернопродуктах сои.

Апробация работы. Исследования проводились в 2001-2010 гг. в Всероссийском научно-исследовательском институте био защиты растений Россельхозакадемии (ВНИИБЗР) по программке базовых и приоритетных прикладных исследовательских работ РАСХН по научному обеспечению Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность развития агропромышленного комплекса Русской Федерации на 2006-2010 гг. «Разработать агротехнологии встроенной защиты растений, использования биобезопасных, экологичных и экономически действенных хим и био средств защиты растений последнего поколения, видов сельскохозяйственных культур, устойчивых к Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность вредным организмам, и на их базе региональных систем управления процессами фитосанитарного оздоровления агроценозов» по шагу «Разработать системы технологий фитосанитарного оздоровления и стабилизации агроценозов на базе оптимизации их по экономической эффективности Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность, био и экологической безопасности».

Главные результаты исследовательских работ раз в год докладывались на ученых советах ВНИИБЗР, также научно-практических конференциях: Интернациональной конференции "Трансгенные растения – новое направление в био защите растений" (ВНИИБЗР, Краснодар, 2002); третьей региональной Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность научно-практической конференции юных учёных "Научное обеспечение агропромышленного комплекса" (КубГАУ, Краснодар, 2001); Интернациональной конференции «Генетически измененные источники еды: оценка безопасности, законодательно-нормативная база, маркетинг», (Москва. 2003); Всероссийской научно-технической конференции "Биотехнология 2003" (Сочи, 2003); VII Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность Всероссийском конгрессе «Здоровое питание населения России» (Москва, 2003); 2-м Столичном международном конгрессе: "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва,2003); 5-ой региональной научно-практич. конф. юных ученых «Научное обеспечение агропромышленного комплекса» (Краснодар, КубГАУ, 2003); Интернациональной конференции «Биологическая защита Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность растений – база стабилизации агроэкосистем» (Краснодар, ВНИИБЗР, 2004); III съезде ВОГиС, «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития» (Москва, 2004); Отчетной научной конференции грантодержателей РФФИ (Сочи, 2004); IV Семинаре-совещании «Средства защиты растений, регуляторы Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность роста, агрохимикаты и их применение при возделывании сельскохозяйственных культур» (Анапа, 2005); Отчетной научной конференции грантодержателей РФФИ (Сочи, 2005); интернациональной конференции «Актуальные вопросы экологии и природопользования» (Ставрополь, 2005); Втором Всероссийском Съезде по защите растений Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность (Санкт-Петербург, 2005); 3-ей интернациональной конференции из серии «Наука и бизнес» «Международное сотрудничество в биотехнологии: ожидания и реальность» (2006,Пущино); Интернациональной научно-практической конференции «Биологическая защита растений – база стабилизации агроэкосистем» (Краснодар.2006); отчетной конференции Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность грантодержателей регионального конкурса РФФИ и администрации Краснодарского края «ЮГ-РОССИИ», «Вклад базовых исследовательских работ в развитие современной инноваторской экономики Краснодарского края» (пос. Агой туапсинского р-на-2006, 2007, 2008); Интернациональной научно-практической конференции «Агротехнический способ Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность защиты растений от вредных организмов» (Краснодар, 2007); 2-й Всероссийской научно-практической конференции Ставропольского отделения Российского энтомологического общества РАН «Проблемы энтомологии Северо-Кавказского региона» (Ставрополь, 2007); 13 съезде Российского энтомологического общества (Краснодар.2007); интернациональной конференции «Информационные системы Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность диагностики, мониторинга и прогноза важных сорных растений, вредителей и заболеваний сельскохозяйственных культур» (Санкт-Петербург–Пушкин, 2008); интернациональной конференции «Биологическая защита растений – база стабилизации агроэкосистем» (Краснодар, 2008); II Интернациональной научно-практической интернет-конференции «Актуальные вопросы энтомологии» (Ставрополь Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность, 2009); Х сессии Генеральной Ассамблеи ВПРС МОББ и Интернациональной научно-практической конференции «Биологические базы регулирования вредных организмов в агроценозах» (Киев, 2009).

Работа поддержана субвенциями Миннауки: "Оценка био эффективности генно-инженерно-модифицированных растений (ГИМР) и Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность разработка способов оценки их биоценотической безопасности", также РФФИ и администрацией Краснодарского края: гранты №№ 03-04-96772, 06-04-96737, 06-04-96644, 09-04-96514, 09-04-96556 и грантом МНТЦ №3768.

Публикации. Главные положения диссертации изложены в 70 научных трудах, в том числе монографии и 9 статьях Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - в изданиях, рекомендуемых ВАК для публикации главных результатов диссертации на соискание ученой степени доктора наук.

^ Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 348 страничках машинописного текста, состоит из введения, 6 глав, выводов, советов, перечня литературы и Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность 4 приложений; содержит 48 таблиц и 60 рисунков. Перечень литературы содержит 404 источника, из их 66 на российском языке.

Создатель выражает искреннюю благодарность и признательность всем соавторам проведенных исследовательских работ: сотрудникам сектора биотехнологии, к.б.н Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность. А.П. Савве и сотрудникам лаборатории гербологии; Ж.А.Ширинян, к.б.н. М.В.Пушне и другим сотрудникам лаборатории массового разведения и внедрения энтомоакарифагов; к.б.н. И.С. Агасьевой и сотрудникам Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность лаборатории поддержания гос. коллекции энтомоакарифагов; д.б.н. О.Д. Ниязову, д.б.н. В.Г.Коваленкову, также зам. директора ВНИИБЗР к.б.н. В.Я.Исмаилову и директору ВНИИБЗР академику Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность РАСХН, доктору В.Д.Надыкте за помощь и поддержку в проведении данных исследовательских работ.


^ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. Молекулярная биология и генная инженерия в практике защиты

растений от вредных насекомых

В главе рассматривается практическое применение технологии молекулярных Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность маркеров для целей защиты растений от вредителей. Показано применение ДНК-маркеров для идентификации видов, исследования генетики популяций нужных и вредных видов насекомых, также мониторинга резистентности вредителей к инсектицидам.

Приводится описание техники Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность трансформации членистоногих для сотворения трансгенных и паратрансгенных насекомых и их внедрение в программках био защиты растений.

Описывается современное состояние исследовательских работ по выращиванию на генном уровне измененных (трансгенных) растений. Рассматриваются выгоды и достоинства их Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность возделывания, также вопросы экологической безопасности на генном уровне измененных растений, устойчивых к вредным насекомым.

^ Глава 2. Материалы и способы

Объект исследования. Объектом исследовательских работ явились подборки из популяций разных видов насекомых, представителей 4 отрядов: полужесткокрылые Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность Hemiptera (клопы Nezara viridula, Graphosoma lineatum, Dolicorys baccarum, Eysarcoris incospicnus, Piesodorus lituratus, Palomena prasina, Pyrrhocoris apterus, Coreus marginatus, Eurygaster integriceps, Perillus bioculatus, Podisus maculiventris); жесткокрылые Coleoptera (колорадский жук Leptinotarsa Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность decemlineata); двукрылые Diptera (муха Ceroxys hortulana); чешуекрылые Lepidoptera (яблонная плодожорка, Cydia pomonella; картофельная минирующая моль Phthorimaea operculella; хлопковая совка Helicoverpa armigera), также растения картофеля (Bt-защищённые сорта картофеля Супериор Ньюлиф («Монсанто», США), Луговской Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность-плюс (Центр «Биоинженерия» РАН), кукурузы (Раундап-устойчивая кукуруза NK 603 RR («Монсанто», США) и сои (Раундап-устойчивая соя сорт Stine 2254 RR («Монсанто», США).

^ Молекулярно-генетический анализ.

Главным способом молекулярно-генетических исследовательских работ являлась полимеразная цепная Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность реакция (ПЦР). Выделение ДНК из насекомых, семян, проростков и листьев растений, амплификацию ДНК (RAPD-, ISSR-PCR) и электрофорез в агарозном геле проводили по протоколам описанным нами ранее [Киль, 2009]. ПЦР проводили на амплификаторе Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность «Терцик» (ДНК-технология, Наша родина) и термоциклере «iCycler» (BioRad, США). Во избежание ошибки опыта RAPD- и ISSR-анализ проводили сразу в одной ПЦР с одним стандартным набором реактивов (Диалат ЛТД, Москва Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность). Сопоставление выборок проводили по воспроизводимым и верно детектируемым ДНК-фрагментам.

SCAR-PCR анализ проводили в 25 мкл обскурантистской консистенции на термоциклере «Терцик» по одной из последующих программ:

- режимы амплификации для 35S-промотора Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность, NOS-терминатора, гена актина сои: 3 минутки 30 секунд при 94°С – подготовительная денатурация, последующих 40 циклов: 20 секунд денатурация при 94°С, 40 секунд отжиг праймеров при - 54°С, 60 секунд синтез при 72°С; последний цикл синтеза 3 минутки при 72°С.

- режимы амплификации Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность для генов CP4 EPSPS, лектина сои, зеин-19: 3 минутки при 94°С – подготовительная денатурация, последующих 50 циклов: 45 секунд денатурация при 94°С, 45 секунд отжиг праймеров при - 60°С, 25 секунд синтез при 72°С; последний цикл Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность синтеза 10 минут при 72°С.

- режимы амплификации для гена Cry3A: 10 минут при 94°С – подготовительная денатурация, последующих 40 циклов: 30 секунд денатурация при 94°С, 30 секунд отжиг праймеров при - 60°С, 30 секунд синтез при 72°С; последний цикл синтеза Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность 7 минут при 72°С.

Электрофорез товаров амплификации (SCAR-PCR) производили в 2% агарозном геле (для детекции ГМ-сои и кукурузы) и в 3% агарозном геле (для идентификации Bt-картофеля) при напряженности электронного поля 5В/см.

Визуализацию ампликонов Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность после подготовительного окрашивания бромистым этидием проводили в ультрафиолете на трансиллюминаторе ECX-20.M (Vilber Lourmat).

Микросателлитный (SSR-PCR) анализ ДНК популяций насекомых яблонной плодожорки и хлопковой совки проводили в 12,5 мкл Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность обскурантистской консистенции, содержащей 10 mM Tris-HCl, pH 9.0, 50 mM KCl, 3,0 mM MgCl2, 50 µM каждого dNTP, 0,4µM каждого из праймеров, 0,5 U TaqДНК полимеразы и 10-50 ng ДНК. SSR-PCR проводили на термоциклере iCycler (BioRad) с Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность подготовительной денатурацией (940С 2 мин) в режиме: денатурация - 940С 30с, отжиг праймера – 580С 40с (для Сp2.39; Сp2.157; HaSSR1; HaSSR3) и 610С 40с (для Сp1.63), элонгация - 720С 40с (35 циклов), конечный синтез - 720С 3 мин.

Продукты SSR Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность-PCR делили в 8% полиакриламидном геле (ПААГ) длиной 20 см, шириной 1 мм при напряжении 300-400 вольт в течение 4-5 часов.

^ Статистический анализ данных.

Молекулярно-генетическую структуру обрисовывали по частотам встречаемости в популяциях ДНК-маркеров и проводили сравнительную оценку Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность по аспекту хи-квадрат и коэффициенту генетического контраста Шеннона. Генетическое обилие оценивали по Шеннону с внедрением формулы: H= - Σ (pi × ln pi), где pi - частота i-го аллеля в выборке Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность [Chalmers, 1992], также другим способом - по Nei и Shennon, из пакета компьютерных программ POPGENE version 1.31 (Francis C.Yeh). Уровень ДНК-полиморфизма оценивали как отношение числа полиморфных ДНК-фрагментов к общему числу ДНК-маркеров.

Сопоставление Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность средних по выборке проводили по аспекту Стьюдента, канонический дискриминантный анализ – с внедрением принятых способов и пакетов прикладных программ (Statistica 6.0 и SPSS 11.0). Кластерный анализ ПЦР-спектров ДНК проводили способом UPGMA (Unweighted Pair Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность-Group Method with arithmetical Averages), определение генетических расстояний меж генотипами - по Nei и Li [Nei, Li, 1979] из пакета компьютерных программ Treecon [Van de Peer, De Wachter, 1994].


^ Глава 3. Фенетические маркеры в исследовании генетической структуры

популяций вредных Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность и нужных насекомых

Рассматривая популяцию с генетической точки зрения, Н.В. Тимофеев-Ресовский и другие исследователи сделали вывод о необходимости выделения фенетики как отдельного направления в популяционно-генетических исследовательских работах. Непременно, внедрение Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность фенетических маркеров, по сопоставлению с молекулярными, в популяционных исследовательских работах обладает рядом преимуществ и, сначала, простотой и доступностью для исследователя, но в тоже время имеет ряд существенных ограничений, о которых Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность мы будем гласить ниже.

    1. ^ Изменчивость фенетической структуры популяций колорадского жука под действием инсектицидов

Целью данного шага исследовательских работ явилось выявление закономерностей изменчивости фенетической структуры популяций колорадского жука в критериях взаимодействия с Bt-картофелем Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность и хим инсектицидами и разработка на этой базе способа прогноза развития резистентности к Bt-картофелю по фенетическим маркерам. В этой связи ставилась задачка создать новейшую систему описания феноформ рисунка переднеспинки колорадского жука Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность.

В текущее время оценку фенетической структуры популяций колорадского жука Leptinotarsa decemlineata проводят, приемущественно, по рисунку переднеспинки взрослых особей в согласовании с методикой, разработанной Фасулати (1986). Но, по нашим данным, данный подход не учитывает всего Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность обилия феноформ в популяции и а именно слияние феноформ «A» понизу меж собой и с фенокомплексами «P» и «M». Потому мы предложили использовать дополнительно к 9 феноформам (по Фасулати) еще фенокомплексы группы «А Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность», описанные Кохманюк (1982) и новые феноформы, описанные нами в первый раз: VР; HР; VHР; HY (набросок 1).

Таковой полный подход, включающий в себя 17 фенокомплексов, оказался оправданным при анализе ряда популяций колорадского жука Краснодарского края, где Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность более нередко встречался конкретно описанный нами фенокомплекс НР (в среднем приблизительно 30%) (таблица 1).

Оценка выживаемости под действием стрессового фактора более нередко встречаемых фенетических групп насекомых выявила тот факт, что они не являются Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность более устойчивыми к воздействию Bt-картофеля и инсектицидов (лептоцид и дурсбан). Выживаемость особей колорадского жука в критериях





Тип №1 Тип №2 Тип №3





Тип №4 Тип №5 Тип №6



Тип №7 Тип №8 Тип №9

Набросок 1 - Главные типы (феноформы) рисунка центральной Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность части переднеспинки имаго колорадского жука (феноформы 1-9 - по Фасулати, 1986; V, H, VH, Y - по Кохманюк, 1982; VР; HР; VHР; HY - по Киль и др., 2004)


Таблица 1 - Средняя частота встречаемости феноформ в популяциях колорадского жука Краснодарского Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность края, % (2001-2003 гг.)


Феноформа


Популяция

краснодарская


темрюкская


староминская


1

4,7

4,3

5,0

2

3,7

1,2

1,7

3

14,0

10,1

10,3

4

1,0

2,0

1,8

5

2,6

2,0

2,2

6

13,6

13,7

13,2

7

1,2

3,0

2,4

8

0,8

2,4

2,1

9

10,7

13,9

12,0

V

2,2

3,4

1,5

Y

4,0

5,0

3,7

VP

1,7

0,2

3,2

HP

27,6*

27,5*

32,1٭

HY

5,5

2,7

3,5

H

4,6

6,5

2,7

VHP

1,4

2,0

2,6

VH

0,1

0,1

0,2

*-достоверно отличается от других феноформ ( tфакт. ≥ t 0,5 )




пестицидного пресса не коррелировала с начальной частотой их встречаемости в популяциях. Так, к примеру, изредка встречаемые насекомые краснодарской популяции фенокомплекса VP являлись более толерантными к Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность инсектицидам (в среднем выживаемость =58,3%), а нередко встречаемые феноформы 3 и НР характеризовались низкой выживаемостью в критериях стресса (в среднем =12,9; 16,4% соответственно). Это указывало на то, что фенетическая структура популяций колорадского жука определяется не только Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность лишь пестицидным, да и другими стрессовыми факторами среды. По всей видимости, чувствительность разных феноформ к инсектицидам не является решающим фактором, определяющим фенооблик популяций колорадского жука.

В то же время направляла на себя Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность внимание относительная стабильность отклика (приблизительно однообразная выживаемость) жуков нередко встречаемых феноформ на различные стрессовые воздействия. Невзирая на низкие характеристики стойкости к инсектицидам, эти фенетические группы насекомых фактически идиентично реагировали на разные по Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность собственному механизму деяния стрессовые причины. Это наблюдение, в свою очередь, позволило нам сделать последующий вывод о механизмах становления структуры популяций колорадского жука: фенетическая структура популяции колорадского жука определяется наличием и соотношением Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность внутрипопуляционных групп особей, имеющих неспецифическую устойчивость к разным стрессам. Этот вывод подтверждался данными статистической обработки. Результаты анализа демонстрировали, что фенокомплексы 3, 6, 9, НР характеризовались меньшей дисперсией (σ²), которая на порядок, а в отдельных случаях Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность и на два порядка, была ниже, чем у других феноформ. При всем этом данная закономерность прослеживалась для всех 3-х исследованных популяций и в течение 2-ух лет испытаний. Возможно, данные фенетические группы особей Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность характеризуются неспецифической устойчивостью к разным стрессовым факторам наружной среды (засуха, холод, зной и др.), что в итоге и обусловливает их самую большую представленность в популяциях (специфичная устойчивость к инсектицидам этих феноформ Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность почти всегда ниже среднего).

Становится понятным роль редчайших феноформ в структуре популяций колорадского жука. Вероятнее всего, конкретно эти фенетические группы насекомых являются собственного рода резервом генов резистентности, отвечающих за специфическую устойчивость, к примеру, к воздействию Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность пестицидов. Благодаря селективному давлению неблагоприятного фактора эти особи могут выдержать значимый пестицидный пресс и получить последующие достоинства по сопоставлению с другими особями, что позволяет популяции в целом выжить. В предстоящем Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность эти, сначало редчайшие феноформы насекомых, ставшие потом доминирующими в популяции, могут дать потомство, в каком произойдет расщепление по данному признаку, приводящее в итоге к реверсии популяции к начальной структуре.

Непременно, увлекательным представлялась возможность Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность проверить универсальность выявленных закономерностей формирования фенетической структуры популяций на других видах насекомых.


    1. ^ Фенетическая структура популяций клопа вредная черепашка

В нашей стране популяционные исследования клопа вредная черепашка Eurygaster integriceps обычно проводятся на базе феноформ Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность рисунка щитка взрослых особей и а именно в Институте Защиты Растений (Санкт-Петербург) [Фасулати, 2005]. Некие исследователи отмечают адаптивный нрав феноформ клопов под действием инсектицидов [Фасулати, 2005; Махоткин, Махоткина, 2006]. В то же время существующая система Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность описания фенетической структуры популяций базируется лишь на 5 фенокомплексах, что с нашей точки зрения очевидно недостаточно и добивалось усовершенствования. При всем этом принципиально было найти, носят ли выявленные выше закономерности Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность формирования фенетической структуры популяций универсальный нрав, другими словами какую роль в адаптивности популяции играют редчайшие и нередко встречаемые феноформы у других видов насекомых, а конкретно клопа вредная черепашка.

В рамках обозначенной трудности на данном Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность шаге исследовательских работ ставилась задачка создать новейшую систему описания фенооблика популяций клопа вредная черепашка, изучить воздействие критерий года, географического положения и хим инсектицидов на фенетическую структуру популяций.

Новенькая система описания фенетической структуры популяций Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность клопа вредная черепашка

Нами была разработана новенькая система описания фенооблика популяций клопа вредная черепашка, которая так же, как и система Фасулати (2005), базировалась на сочетании признаков рисунка и расцветки частей тела насекомого. Предложенная Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность нами система описания включала в себя 15 фенокомплексов щитка и 10 морфотипов брюшка (таблицы 2 и 3).

Для апробации новейшей системы описания феноформ мы проанализировали фенетическую структуру 2-ух выборок краснодарской популяции клопа вредная черепашка Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность. Данные по частотам встречаемости разных феноформ в популяции клопа вредная черепашка приведены в таблице 4.

Можно увидеть, что фактически все фенотипические классы предлагаемой системы описания были представлены в обеих подборках, не считая фенокомплексов щитка №1 и №3. Но Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность это не исключало их присутствие при описании других популяций, что в реальности нами и было найдено в предстоящем при фенетическом анализе ставропольской популяции [Киль и др., 2007].

В целом фенооблик обеих выборок Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность, ВНИИБЗР и Елизаветинской (по щитку и брюшку) был схож, о чем свидетельствовал и статистический анализ данных рассредотачиваний (2 факт. = 0, 9 и 1,9, что меньше 2 05). Это позволяло заключить, что данные подборки принадлежали, возможно, к одной Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность популяции, а предлагаемая нами система описания феноформ полностью применима для оценки изменчивости фенетической структуры популяции клопа вредная черепашка и исследования популяционных процессов этого вида насекомых.

^ Таблица 2- Систематизация феноформ щитка клопа вредная Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность черепашка





фенокомплекса

Признак

Расцветка щитка

Контрастность рисунка

1

Желтоватый

Контрастный

2

Желтоватый

Слабенький

3

Желтоватый

без рисунка

4

Карий

Контрастный

5

Карий

Слабенький

6

Карий

без рисунка

7

Бурый

Контрастный

8

Бурый

Слабенький

9

Бурый

без рисунка

10

черный, серо-коричневый

Контрастный

11

черный, серо-коричневый

Слабенький

12

черный, серо-коричневый

без рисунка

13

темно-бурый

Слабенький

14

темно-бурый

без рисунка

15

Темный

без рисунка



^ Таблица 3 - Систематизация феноформ брюшка клопа вредная черепашка





фенокомплекса

Признак

Расцветка брюшка

Наличие рисунка

1

Оранжевое

Набросок находится

2

Оранжевое

Без рисунка

3

Бурое

Набросок находится

4

Бурое

Без рисунка

5

Желтоватое

Набросок находится

6

Желтоватое

Без рисунка

7

темно-серое

Набросок Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность находится

8

темно-серое

Без рисунка

9

Коричневое

Набросок находится

10

Коричневое

Без рисунка



Таблица 4 – Частота встречаемости феноформ в краснодарской популяции клопа вредная черепашка, % * (2006 г.)



Фено-

комплекс

Подборка из популяции



ВНИБЗР


Елизаветинская

ВНИБЗР

самки

ВНИБЗР самцы

Елизаветинская самки

Елизаветинская

самцы

Щиток

1

0

0

0

0

0

0

2

1,0

0,5

0

2,0

0,5

0,5

3

0

0

0

0

0

0

4

23,0

20,1

16,1

30,1

14,2

28,4

5

9,7

9,2

6,5

13,1

6,4

12,2

6

7,5

9,2

7,7

7,2

8,7

9,6

7

2,6

2,3

0

5,2

0,5

4,6

8

7,8

8,7

5,2

10,5

5,5

12,2

9

5,5

5,8

4,5

6,5

6,0

5,6

10

13,0

14,0

11,0

15,0

15,1

12,7

11

13,6

13,5

24,5

2,6

20,6

5,6

12

10,7

10,4

18,1

3,3

15,6

4,6

13

1,3

1,9

1,9

0,7

1,8

2,0

14

2,0

1,4

1,3

2,6

1,4

1,5

15

2,3

2,2

3,2

1,3

3,7

0,5

2

0,9

46,2**

29,7**

Брюшко

1

2,9

3,1

1,9

3,9

2,8

3,6

2

2,6

1,7

0,6

4,6

0

3,6

3

20,8

17,1

12,3

29,4

9,2

25,9

4

24,7

22,9

14,8

34,6

15,6

31,0

5

17,5

17,1

33,5

1,3

28,9

4,1

6

1,9

2,7

1,9

2,0

3,7

1,5

7

1,0

0,7

1,9

0

1,4

0

8

3,6

2,7

0

7,2

0

5,6

9

19,2

25,5

29,7

8,5

35,3

14,7

10

5,8

6,5

3,2

8,5

3,2

10,2

2

1,9

71,8**

55,4**

* - % от полного количества всех особей в выборке, для самцов и самок – от полного Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность количества самцов и самок соответственно;

** - различия достоверны (2 факт. 2 05 )


^ Изменчивость фенетической структуры популяций клопа вредная черепашка под воздействием разных причин наружной среды:

А. Географическое положение

С внедрением разработанной нами системы описания феноформ расцветки и рисунка Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность имаго клопа вредная черепашка был проведен сравнительный анализ фенооблика краснодарской и ставропольской популяций насекомых. При описании феноформ щитка выявились статистически важные отличия в фенетической структуре популяций. Меж самцами и самками следили статистически Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность важные отличия. При всем этом более важные отличия меж полами следили по феноформам брюшка у обеих популяций (2 факт. 2 05). Сразу с этим желтоватое брюшко с узором (фенокомплекс № 5) встречалось практически только у самок. Не Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность считая того, самки с феноформами брюшка № 5 и 9 встречались более нередко (выше 60 % от всех самок).

Приобретенные данные указывали на сцепленность генов расцветки и рисунка имаго клопов с полом. Полностью возможно Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность, что желтоватый цвет брюшка у самок клопа вредная черепашка играет важную роль при спаривании, привлекая особей обратного пола. Так ранее установлено, что желтоватый цвет является привлекающим фактором для многих видов насекомых, в Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность том числе и клопов. Этот факт известен энтомологам издавна и в текущее время применяется при изготовлении цветоловушек для защиты садовых насаждений [Васильева, 2006].

Таким макаром, фенетическая структура популяций клопа вредная черепашка подвержена изменчивости зависимо от Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность географического положения популяции. Отмечены статистически важные отличия в фенооблике краснодарской и ставропольской популяций, также сцепление генов рисунка и расцветки клопов с полом. Это указывало на то, что исследуемые группы особей Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность относятся к различным популяциям насекомых (этот вывод подтверждался также данными молекулярно-генетических исследовательских работ, глава 4 диссертации), а исследование популяционных процессов по фенетическим маркерам нужно проводить с учетом половых различий.

^ Б. Инсектициды

Дальше проводили оценку изменчивости фенетической Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность структуры популяции клопа вредная черепашка под действием инсектицидов различного диапазона деяния, Би-58 Новый и суми-альфа. Воздействие инсектицидов приводило к значимым изменениям в фенетической структуре популяции. При всем этом Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность нрав изменчивости фенетической структуры зависел от природы инсектицида.

Оценка выживаемости под действием инсектицидов более нередко встречаемых фенетических групп насекомых выявила также тот факт, что они не являются более устойчивыми к воздействию стрессового фактора. Выживаемость Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность клопов вредной черепашки в критериях пестицидного пресса не коррелировала с частотой их встречаемости в популяции. Таким макаром, чувствительность насекомых разных феноформ к инсектицидам не является решающим фактором, определяющим фенооблик популяции клопа Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность вредная черепашка, как указывали некие создатели [Фасулати, 2005; Беньковская и др., 2004; Рославцева, 2005], потому что насекомые редчайших феноформ, обычно, имеют более высшую толерантность к инсектицидам. Это согласуется с нашими исследовательскими работами на колорадском Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность жуке [Киль, Головатенко, 2006].

Не считая того, направляла на себя внимание относительная стабильность отклика (приблизительно однообразная выживаемость) клопов нередко встречаемых феноформ на различные стрессовые воздействия. Невзирая на низкие характеристики стойкости к инсектицидам, нередко встречаемые Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность фенетические группы насекомых фактически идиентично реагировали на разные по механизму деяния стрессовые причины, что наглядно показывали результаты статистического анализа: более нередко встречаемые в популяции феноформы характеризовались меньшей дисперсией (σ²), которая на порядок, а Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность в отдельных случаях и на два порядка, была ниже, чем у других феноформ.

Таким макаром, приобретенные данные подтверждают изготовленный нами ранее (на колорадском жуке) вывод о механизмах становления структуры популяций насекомых и Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность универсальность данных устройств адаптивности популяций насекомых к стрессовым факторам наружной среды: фенетическая структура популяции определяется наличием и соотношением внутрипопуляционных групп особей, имеющих неспецифическую устойчивость к разным стрессам.

В то же время для Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность достоверности оценки резистентности популяции по феноформам нужно, кроме наличия сцепления генов резистентности с генами рисунка и расцветки, соблюдение последующего принципиального условия: паратипическая составляющая признака должна быть, по сопоставлению с генотипической компонентой, относительно Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность низкой. Этой части исследовательских работ посвящен последующий раздел.

^ В. Условия года

Бесспорный энтузиазм представляло исследование воздействия критерий года на фенетическую структуру популяции клопа вредная черепашка. Основной целью данного шага исследовательских работ было найти величину Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность паратипической составляющие признака «рисунка и окраски» клопов. Результаты оценки фенооблика популяции клопа вредная черепашка зависимо от критерий года приведены в таблице 5.

Стоит отметить, что погодные условия были обычными для г. Краснодара исключительно Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность в 2006 году, что подтверждалось данными 2005-2006 гг. – фенетическая структура популяции в эти годы в целом не изменялась. Напротив, погодные условия 2007 года (горячие и засушливые весна и лето), когда температура уже в мае Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность достигала 400С и выше и держалась в протяжении четырех-пяти месяцев при практическом отсутствии осадков, привели к значимым изменениям в фенетической структуре популяции клопа вредная черепашка 2007-2008 гг. Экстремальные погодные условия 2007 года привели краснодарскую популяцию Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность клопа вредная черепашка к значимой элиминации, так что это вызвало депрессию численности клопов в 2008 году, и нам с трудом удалось собрать материал для фенетического анализа. Это драматично отразилось и Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность на фенетической структуре популяции 2008 года, что подтверждали данные статистической обработки (таблица 5).


Таблица 5 – Частота встречаемости феноформ краснодарской популяции клопа

вредная черепашка в различные годы исследовательских работ (юные особи)*, %



Фенокомп-

Лекс

Самки

Самцы


2006

2007

2008

2006

2007

2008

Щиток

1

0

1,1

0

0

0

5,0

2

0,2

4,1

2,4

1,3

1,8

1,4

3

0

4,0

0

0

2,4

0

4

15,2

24,7

25,0

29,3

21,1

36,6

5

6,5

17,7

33,9

12,7

15,1

21,7

6

8,2

10,8

10,5

8,4

13,6

5,0

7

0,3

4,5

12,1

4,9

7,3

14,9

8

5,4

3,9

6,5

11,3

6,7

4,0

9

5,3

2,2

0,8

6,1

2,8

0,5

10

13,1

10,0

4,8

13,8

13,1

2,0

11

22,5

8,4

3,2

4,1

10,8

3,0

12

16,8

1,8

0

3,9

0,5

0

13

1,8

3,9

0,8

1,3

3,2

4,0

14

1,4

2,4

0

2,1

0,9

1,4

15

3,5

0,5

0

0,9

0,7

0,5

2




43,9**

78,2**




15,1

36,8**

Брюшко

1

2,4

0,5

0

3,7

0,9

0

2

0,3

0

0

4,1

0,8

0

3

10,8

5,2

0

27,7

14,4

2,3

4

15,2

10,5

0

32,8

20,0

2,3

5

31,2

19,7

81,5

2,7

9,9

19,8

6

2,8

4,2

4,0

1,8

5,3

12,9

7

1,7

0,2

0

0

0,2

0,5

8

0

0,5

0

6,4

1,0

0

9

32,5

44,8

9,7

11,6

29,2

24,3

10

3,2

14,4

4,8

9,3

18,3

37,6

2




18,0**

65,7**




31,7**

106,0**

*- общее число особей в 2006 г. – 723; 2007 г. - 871; 2008 г Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность. – 326;

** - есть статистически важные различия меж 2-мя рассредотачиваниями, по отношению к 2006 г. (2 факт  2 таб.)



Сравнительный анализ воздействия разных причин наружной среды на фенетическую структуру популяции клопа вредная черепашка приведен в таблице 6.

Таблица 6 – Воздействие Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность разных причин на фенетическую структуру популяции клопа вредная черепашка (значения 2 )


Фактор

Самки

Самцы

Щиток

Брюшко

Щиток

Брюшко

Географическое положение

50,4*

15,1*

31,5*

24,6*

Условия года


43,9*

18,0*

15,1

31,7*

Инсектицид Би58 Новый

36,3*

36,3*

31,9*

13,7

Инсектицид

суми-альфа

30,5*

30,5*

16,2

51,0*

* - 2 факт  2 05



Можно увидеть, что воздействие критерий года в неких случаях было даже более значимым, чем Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность воздействие инсектицидов. Понятно, что сила воздействия фактора будет изменяться зависимо от меняющихся критерий наружной среды, природы инсектицида и кратности обработок.

Таким макаром, можно заключить, что паратипическая компонента признака «рисунок и окраска» щитка Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность и брюшка клопа вредная черепашка очень значительна, что ставит под вопрос возможность использования фенетических маркеров при мониторинге резистентности популяций этого вредителя к инсектицидам. По-видимому, морфологический анализ популяций клопа вредная черепашка Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность и построенная на нем система мониторинга резистентности к инсектицидам не может являться полностью достоверной ввиду наличия значимой модификационной изменчивости фенетических маркеров в меняющихся критериях наружной среды. Потому прогноз резистентности по феноформам рисунка имаго Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность либо другим морфологическим аспектам можно рассматривать только только в качестве подготовительной, грубой оценки, как мы уже отмечали ранее на колорадском жуке [Киль, Головатенко, 2006], и по мере надобности можно дополнить проведением молекулярно Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность-генетического анализа с внедрением а именно RAPD-маркеров.

    1. ^ Генетический контроль феноформ расцветки щитка и переднеспинки клопа периллюса

Северо-Американский плотоядный клоп периллюс Perillus bioculatus - спец энтомофаг колорадского жука, являлся объектом пристального внимания Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность ученых в протяжении многих десятилетий ХХ века. Пробы его акклиматизации в почти всех странах не дали положительных результатов. В мае 2008 года при обследовании зарослей амброзии полыннолистной (на местности ВНИИБЗР), оставленной на поле люцерны в Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность качестве резервата амброзиевого листоеда Zygograma suturalis, были обнаружены бессчетные личинки периллюса (от 10 до 20 экз/м2 ), интенсивно питающиеся гербифагом. Это предназначило большой энтузиазм к хищнику, потому что вид, разумеется, без помощи других Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность освоился и распространился в агроэкосистемах юга Рф.

В краснодарской популяции клопа P. bioculatus нами были выделены три верно различающихся по расцветке щитка и переднеспинки меж собой феноформы: красно-черная, желто-черная и Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность бело-черная. В 2009 г. популяция периллюса была представлена самой бессчетной красно-черной феноформой - до 70% популяции, бело-черной и оранжево-черной - до 15% любая. Данный фенетический полиморфизм может явиться неплохим инвентарем в последующих популяционных исследовательских работах Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность этого вида насекомых. Но внедрение феноформ для этих целей должно базироваться на знании генетики этого признака, его наследуемости и изменчивости.

Целью данного шага исследовательских работ являлось исследование молекулярно-генетического полиморфизма популяции Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность клопа периллюса по признаку «окраска щитка» насекомого. В этой связи ставилась задачка провести ПЦР анализ 3-х исследуемых внутрипопуляционных групп особей.

В общей трудности было испытано 25 RAPD- и 15 ISSR-праймеров. Более точные Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность отличия меж исследуемыми группами насекомых следили только по RAPD-праймеру ОРЕ07, что подтверждалось данными кластерного анализа. Следили фактически полное разделение RAPD-фенотипов на три кластера, соответственно признаку расцветки щитка. Это указывало Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность на наличие сцепления отдельных ДНК-маркеров с генами, контролирующими расцветку щитка насекомого. А именно RAPD-локус размером 750 пар нуклеотидов (п.н.) наблюдался только у белоснежных особей, тогда как локусы 370 и 390 п.н. – только у Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность клопов с красноватым щитком.

Таким макаром, результаты проведенных исследовательских работ указывали на наличие генетического контроля данного признака, что, в свою очередь, делает вероятным внедрение феноформ расцветки в последующих популяционных исследовательских Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность работах P. bioculatus.




teoreticheskie-metodologicheskie-i-metodicheskie-problemi-psihologicheskoj-pomoshi-detyam.html
teoreticheskie-modeli-mezhdunarodnoj-integracii.html
teoreticheskie-oshibki-v-tolkovanii-umstvennoj-otstalosti-i-vrednie-posledstviya-etih-oshibok-v-praktike-napravleniya-rebenka-v-korrekcionnuyu-shkolu-vosmogo-vida.html